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Peter Parker était un lycéen brillant mais socialement peu intégré, élevé par son oncle et sa tante, Ben et May Parker, après la disparition de ses parents. Un jour, alors qu’il assistait à une exposition scientifique, Peter fut mordu par une araignée génétiquement modifiée, une piqûre qui ne tarda pas à le doter de capacités surhumaines. Initialement, Peter décida d’utiliser ses pouvoirs comme catcheur masqué, espérant gagner de l’argent et impressionner sa jeune voisine, Mary-Jane Watson. Cependant, quand le propriétaire de la salle de catch refusa de le payer, Peter laissa s’enfuir un voleur qui venait de dérober la caisse de la salle. Malheureusement, peu après, ce même voleur tuait Ben Parker. Submergé par la culpabilité, Peter se rappela alors les paroles de son oncle sur la responsabilité et le jeune garçon décida alors de devenir un justicier, adoptant l’identité de Spider-Man. A la même époque, Peter trouva un emploi comme photographe pour le quotidien Daily Bugle, dont le propriétaire, J. Jonah Jameson, était un adversaire acharné du nouveau héros. Celui-ci fit bientôt à un adversaire costumé, le Bouffon vert, qui était en réalité Norman Osborn, père de Harry Osborn, le seul véritable ami de Peter. Lors de leur premier affrontement, Spider-Man réussit à protéger la foule de l’attaque du Bouffon, qui proposa alors une alliance à Spidey, pour prendre ensembles le contrôle de la ville. Spider-Man refusa et le Bouffon lui promit de faire de sa vie un enfer. Peu de temps après, lors d’une réunion familiale, Norman Osborn comprit la double identité de son ennemi et s’attaqua alors à May Parker. Furieux, Peter se lança sur ses traces, découvrant que Norman Osborn venait de kidnapper Watson. Une nouvelle fois, Spider-Man put sauver la jeune femme mais, au cours du duel qui s’en suivit entre lui et le Bouffon vert, ce dernier fut tué par sa propre planche volante ; agonisant, il supplia Peter de cacher la vérité à Harry. Accédant à sa demande, Spider-Man ramena le cadavre de Norman chez celui-ci, où il fut aperçu par Harry qui jura de se venger du tisseur.
Deux ans plus tard, maintenant étudiant, Spider-Man fit face à un nouveau défi, plus personnel, tentant de mener de front sa vie héroïque et sa vie privée. La plupart des ses relations étaient mises en danger par ses activités de justicier, une situation qui atteint son point critique quand il dut faire face au Dr Otto Octavius, un savant autrefois financé par l’entreprise Osborn et qui était devenu un criminel doté de quatre tentacules métalliques répondant à ses pensées. Peter s’était aussi éloigné de Mary-Jane Watson, ou plutôt celle-ci avait décidé de mener sa propre vie, loin d’un ami peu fiable, commençant une carrière de comédienne sur la scène new-yorkaise et maintenant fiancée à John Jameson, fils de l’éditeur du Bugle. Sa relation avec Harry se dégradait aussi, d’abord à cause des liens entre Peter et Spider-Man, que Harry tenait pour responsable de la mort de son père, et ensuite à cause des difficultés financières engendrées par l’échec des travaux d’Octavius. Du coup, après une nouvelle altercation avec Octavius, le stress de la situation amena Peter à perdre ses pouvoirs, ce qui le conduisit à renoncer à son identité de Spider-Man. Toutefois, quand Doc Ock kidnappa Watson pour attirer Spider-Man dans un traquenard, Peter n’eut d’autre choix que d’accepter son destin et mobilisa tous ses pouvoirs et sa volonté pour affronter son ennemi et arrêter le savant devenu fou qui cherchait à construire une centrale nucléaire infinie. Les deux hommes s’affrontèrent dans le repaire d’Octavius, qui finit par sacrifier sa vie en comprenant que son expérience menaçait l’existence de New York ; durant le combat, Peter dut également révéler sa double identité à Watson. Comprenant le dilemme vécu par Peter ces derniers mois, la jeune femme rompit ses fiançailles et se réconcilia avec Peter.
La vie s’améliora alors grandement pour Peter. La ville elle-même l’acclamait pour la première fois de sa carrière, ses études se déroulaient bien et il envisageait même de demander Watson en mariage. Néanmoins, Harry Osborn, qui avait découvert la double identité de Peter durant son affrontement avec Octavius, l’attaqua par surprise un soir, bien décidé à venger son père. Spider-Man réagit en repoussant brusquement le nouveau Bouffon, et le choc à la tête reçu par Harry lui donna une amnésie partielle. Peu après, Peter apprit que le véritable assassin de son oncle s’appelait Flint Marko, qui, fuyant la police, subit une transformation génétique qui fit de lui l’Homme-Sable. Le jeune homme fut alors infecté par un symbiote d’origine extra-terrestre qui accrut encore ses pouvoirs mais modifia également son comportement, le rendant plus agressif, plus sûr de lui et plus violent. Ainsi, lors d’un combat avec Marko, Spider-Man crut avoir tué son ennemi. Entre temps, Harry avait retrouvé la mémoire et attaqua de nouveau Peter, mais l’une des bombes du Bouffon explosa à proximité d’Osborn, qui s’en retrouva défiguré. Réalisant alors que le symbiote le transformait lentement, Peter résolut de s’en séparer et crut s’en débarrasser complètement mais le symbiote survécut et s’attacha à Eddie Brock, rival malheureux de Peter au Bugle et qui devint alors Venom, lui aussi déterminé à se venger de Spider-Man et connaissant sa double identité grâce au symbiote. Après avoir formé une alliance avec l’Homme-Sable, Venom enleva Watson et les deux criminels l’utilisèrent pour tendre une embuscade à Spider-Man. Quand le héros vint au secours de son amie, il fut dépassé par la force combinée de ses deux ennemis ; il était sur le point de succomber quand le Bouffon, dont les blessures lui avaient permis de réaliser son erreur, vint à son aide. Les deux amis affrontèrent l’Homme-Sable et Venom ; quand ce dernier tenta d’empaler Spider-Man, le Bouffon s’interposa et fut mortellement blessé, comme son père l’avait été auparavant. Spider-Man utilisa alors les bombes de son ami pour disperser l’Homme-Sable, avant de se débarrasser de Venom. Le héros laissa même Marko libre, lui pardonnant la mort de son oncle.
Plus tard, Spider-Man fut recruté au sein de la Spider-Armée afin de participer à la lutte contre les Héritiers. Il participa à l’assaut final contre leur base sur la Terre-001.
Spider-Man possède des capacités physiques surhumaines, notamment sa force, qui lui permet de soulever environ 20 tonnes. Sa force fut encore augmentée quand il portait le symbiote extra-terrestre. Spider-Man peut aussi se déplacer à une vitesse surhumaine et peut atteindre au moins 45 kilomètres par heure en courant. De même, l’endurance et la résistance de Spider-Man sont bien supérieures à la norme humaine ; il peut exercer une activité physique intense pendant plusieurs heures avant de ressentir de la fatigue et son corps résiste à des impacts qui blesseraient des êtres humains standards ; en parallèle, il récupère de ses blessures ou de la fatigue bien plus rapidement que la normale humaine. Ainsi, alors qu’il souffrait de myopie avant sa transformation, Peter a découvert que sa vue était redevenue normale après sa piqûre. Son agilité est extraordinaire : son adresse, sa flexibilité et ses réflexes atteignent des niveaux bien au-delà des limites du meilleur athlète humain. Son agilité est à peu près deux fois plus grande qu’un tel athlète tandis que ses réflexes sont environ 30 fois supérieurs à ceux d’un humain normal. Spider-Man est doté d’un sixième sens, ou « sens d’araignée » qui l’avertit des dangers potentiels immédiats en se manifestant sous la forme d’un picotement sur sa nuque ; cette sensation est reliée à ses réflexes surhumains, ce qui lui permet d’esquiver la plupart de ses agressions, sauf s’il demeure volontairement sur place, ignorant ses réactions instinctives. Si ce sixième sens ne permet pas d’identifier la nature de la menace, la force du picotement donne une indication sur sa gravité ; une menace extrême produira ainsi une douleur presque insupportable pour Spider-Man. Ce sixième sens, combiné aux réflexes et à l’agilité de Spider-Man, lui permet d’esquiver la plupart des attaques, même les tirs de balles, s’il est à une distance suffisante. Spider-Man peut adhérer aux surfaces et escalader les parois verticales ou même s’accrocher aux plafonds. Spider-Man produit une toile organique qu’il peut projeter à partir de ses poignets ; cette toile est adhésive, extrêmement résistante et élastique dans certaines limites.
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Peter Parker est extrêmement doué dans le domaine des sciences, notamment en physique et biochimie. Ses capacités ont impressionné des savants expérimentés comme le Dr Curt Connors ou le Dr Otto Octavius.