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Alors qu’il était encore un enfant, Peter Parker découvrit que sa maison avait été cambriolée et que les recherches scientifiques de ses parents avaient été volées, tandis qu’eux-mêmes avaient disparu, avant de trouver officiellement la mort dans le crash de leur avion. Il fut alors élévé par son oncle et sa tante, Ben et May Parker ; ayant le sentiment d’avoir été abandonné par ses parents – son oncle et sa tante lui ayant caché leurs morts – il devint un enfant renfermé sur lui-même, peu sociable en dehors de la maison familiale. Malgré tout, dès l’école, il se fit un ami en la personne de Harry Osborn, du moins jusqu’à ce que celui-ci soit envoyé en pension, laissant de nouveau seul Peter, qui commença alors à être harcelé par Flash Thompson, la star sportive du lycée, tout en ignorant que la jeune Gwen Stacy l’avait repéré. Rentrant un soir, Peter découvrit la mallette de son père dans la cave, et apprit alors la vérité sur la disparition de ses parents et que ceux-ci avaient travaillé pour la société OsCorp, en collaboration avec le Dr Curt Connors, sur un projet visant à mêler l’ADN humain avec celui de différentes espèces animales. Cherchant des réponses, il se rendit à OsCorp pour s’entretenir avec Connors mais, en fouillant le laboratoire de ce dernier, il laissa échapper une araignée génétiquement modifiée, qui le mordit. Dès le lendemain, Peter découvrit qu’il avait acquis des capacités surhumaines, transmises par l’araignée. Initialement effrayé par ses pouvoirs, il effectua des recherches sur les morsures d’araignées mais fut incapable d’identifier l’araignée qui l’avait mordu ; il rendit de nouveau visite à Connors, lui révélant alors qu’il était le fils de Richard Parker, avant de lui donner les travaux de son père qu’il avait retrouvé et qui concernaient une formule de régénération des membres. Les jours suivants, au lycée, il se vengea de Thompson, tout en s’attirant de nouveaux ennuis ; malgré cela, quand il invita Stacy à sortir avec lui, la jeune femme, à sa grande surprise, accepta son invitation. Le soir-même, ignorant les appels de son oncle, il retrouva le Dr Connors pour travailler avec lui sur la formule ; à son retour, il se disputa avec Ben Parker, quittant la maison furieux. Malheureusement, peu après, Ben Parker fut tué par un voleur que Peter venait de laisser filer dans une boutique du quartier, ne se sentant pas concerné par l’incident. Comprenant vite que le voleur et l’assassin de son oncle ne faisaient qu’un, Peter se lança sur ses traces, cachant son visage derrière un masque, avant de se confectionner un uniforme complet et mettre au point une toile synthétique, attirant alors l’attention du capitaine de police George Stacy, le père de Gwen.
Rapidement, la carrière de Spider-Man devint le sujet de toutes les discussions, y compris au repas familial des Stacy où Peter avait été invité par Gwen. Juste après lui avoir révélé sa double identité, il dut la laisser sur place pour répondre à une alerte de la police. C’est là qu’il fit face pour la première fois au monstrueux Lézard ; s’il put sauver la vie d’un enfant menacé par la créature, il ne put arrêter celle-ci. En retrouvant Connors le lendemain, Peter réalisa que le savant n’était autre que le Lézard ; quand le capitaine Stacy refusa de l’écouter, Peter, comme Spider-Man, décida de s’occuper lui-même du monstre, partant à sa recherche dans les égouts. Mais, une nouvelle fois, le combat tourna à son désavantage, Spider-Man fut blessé et laissa sur place une caméra de poche qui permit au Lézard de deviner la double identité de son ennemi. Du coup, le Lézard attaqua le lycée de Peter dans le but de l’éliminer mais le jeune héros put lui tenir tête jusqu’à l’arrivée de la police, qui obligea le Lézard à battre en retraite. Peter demanda à Gwen de préparer un antidote à OsCorp mais la jeune femme se retrouva piégée dans le bâtiment, obligeant Spider-Man à s’y précipiter pour la sauver du Lézard. Poursuivi par la police sur le trajet, il leur échappa de justesse mais, pour sauver Gwen, dut révéler la vérité au capitaine Stacy ; comprenant que le jeune homme cherchait avant tout à aider la ville, il le laissa entrer dans le bâtiment. Cependant, blessé par un autre policier, Spider-Man ne put résister au Lézard ; alors que le héros était sur le point de succomber, George Stacy arriva, ouvrant le feu sur le Lézard, permettant au jeune héros de lui échapper et d’utiliser alors de l’azote liquide pour l’immobiliser et le rendre plus vulnérable. Mais, le temps que Spider-Man ne récupère l’antidote fabriqué par Gwen, le Lézard avait mortellement blessé le capitaine ; Spider-Man réussit à redonner forme humaine au Lézard mais Stacy mourut dans ses bras, lui promettant de ne plus mettre en danger sa fille. Suscitant l’incompréhension de cette dernière, Peter rompit alors tout contact avec Gwen pour respecter les dernières volontés du défunt, bien que la jeune fille soupçonna rapidement la vraie raison derrière la brusque froideur de Peter à son égard. Obligé de dire la vérité à Gwen, elle et Peter se réconcilièrent alors.
Pendant ce temps, Peter poursuivait sa carrière héroïque ; c’est ainsi qu’il dut se lança sur les traces du criminel Aleksei Sytsevich qui avait volé un camion d’Oscorp rempli de produits radioactifs, le capturant ; ce faisant, il continuait à avoir des visions du corps de George Stacy et, lors de leur remise de diplôme, il annonça à Gwen qu’il rompait de nouveau avec elle. Toujours désireux de découvrir la vérité sur ses parents, Peter reprit peu après contact avec Harry Osborn, qui venait de reprendre la tête d’OsCorp après le décès de son père Norman. Peu de temps après, Peter et Gwen allèrent dîner ensembles, essayant de rester amis même après leur rupture et Gwen annonça à Peter qu’elle envisageait d’aller étudier à Oxford où elle avait obtenu une bourse. Leur soirée fut interrompue par la première apparition publique de Max Dillon qui venait d’acquérir de pissants pouvoirs électriques ; mais l’intervention brutale de la police poussa Dillon dans ses retranchements et il se mit à libérer sa puissance tout autour de lui, ravageant Times Square ; avant qu’il ne blesse quiconque, Spider-Man put l’étourdir d’un coup et Electro fut confié à OsCorp afin d’être examiné et étudié. De son côté, Peter était de plus en plus frustré de ne pas obtenir les réponses qu’il espérait sur ses parents. Puis, il fut recontacté par Harry afin d’obtenir son aide pour découvrir un remède à la maladie héréditaire dont il souffrait, une hyperplasie rétrovirale, qui avait causé la mort de Norman Osborn. Harry se doutait que Spider-Man devait ses pouvoirs aux travaux génétiques menés par la OsCorp et pouvaient être une source de remède, il demanda à Peter, qui prenait régulièrement des photos du héros, d’entrer en contact avec celui-ci. Evidemment, Harry ne se doutait pas que Peter et Spider-Man étaient une seule et même personne. Comme Spider-Man, il alla trouver Harry pour parler avec lui, refusant de lui donner un échantillon de sang, de peur que son ami ne se transforme comme Connors. A la maison, Peter eut une conversation avec sa tante, qui avait découvert l’ampleur des recherches de son neveu sur ses parents, lui révélant qu’après leurs morts, ils avaient reçu la visite du FBI qui leur avait annoncé que les Parker étaient des traîtres qui avaient tenté de vendre leurs travaux à une puissance étrangère. Déchiré entre ces révélations, le prochain départ de Gwen et les demandes de Harry, Peter perdit le contrôle de lui-même, détruisant ses recherches puis la mallette de son père ; ce faisant, il y découvrit, parmi les restes, des jetons du métro.
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Suivant cette piste, Peter finit par découvrir le laboratoire secret de son père, dans une section abandonnée du métro de New York, et y trouva un enregistrement de Richard Parker, réalisé la nuit de sa fuite. Peter apprit ainsi que c’est Norman Osborn qui avait vendu leurs travaux, créant de fausses preuves contre les Parker et que les araignées génétiquement modifiées avaient été encodées spécifiquement pour son ADN et qu’elles ne pourraient agir qu’avec les personnes issues de ses propres gènes, soulageant Peter de sa culpabilité envers son refus de donner son sang à Harry Osborn. A peine était-il parti que Gwen lui envoya un message, lui annonçant son départ le jour même ; il se précipita alors pour la retrouver, incapable de renoncer à Gwen et lui annonçant qu’il était prêt à la suivre en Angleterre si nécessaire. Mais, avant qu’ils ne puissent en discuter, la ville se retrouva plongée dans le noir ; ils réalisèrent aussitôt que Dillon était le responsable et Gwen aida Peter à magnétiser ses lance-toiles afin qu’ils ne puissent plus être court-circuités par Dillon comme il avait réussi à le faire à Times Square. Se rendant à la centrale électrique, Spider-Man fit face à Dillon, qui revendiquait à présent le nom d’Electro. Les deux hommes s’affrontèrent au milieu des piliers électriques et, tandis qu’Electro était en train de prendre le dessus, Gwen arriva sur les lieux, renversant le criminel avec la voiture de police où le héros l’avait enfermée quelques minutes plus tôt ; en dépit des exhortations de Spider-Man, elle refusa de quitter les lieux, affirmant qu’elle était la seule à pouvoir relancer la station électrique. Epuisé, Spider-Man céda et ils mirent ensembles un plan pour surcharger Electro comme s’il était une batterie vivante ; pendant que les deux hommes reprenaient leur combat, Gwen se précipita à l’intérieur de la station. Spider-Man réussit à relier les principaux câbles électriques entre eux grâce à sa toile juste avant que Gwen ne relance la centrale électrique, envoyant toute l’énergie vers Electro. Celui-ci, en pleine surcharge, explosa comme les héros l’avaient escompté.
Peter et Gwen n’eurent guère le temps de profiter de leur victoire car ils furent immédiatement attaqués par Harry, qui avait absorbé et un échantillon du venin d’araignée mis au point par Richard Parker, subissant une mutation lui donnant des capacités surhumaines. Voyant Spider-Man et Gwen ensembles, Harry en déduisit la véritable identité du héros et, se sentant trahi par son ami Peter, décida de se venger de lui, kidnappant Gwen qu’il emmena au sommet d’une tour d’horloge du voisinage. Une première fois, Spider-Man put sauver Gwen quand Harry la laissa tomber du sommet ; cependant, durant la lutte qui s’en suivit entre Spidey et Harry, Gwen se retrouva vite suspendue dans l’air, évitant une chute mortelle grâce à la toile de Spider-Man. Malgré tous les efforts de Harry, ce dernier fut finalement battu par Spider-Man, mais la toile retenant Gwen céda alors. Le tisseur tira une autre toile, la rattrapant avant qu’elle ne heurte le sol mais, une fois son amie dans ses bras, il réalisa qu’elle était morte, le choc de son arrêt brutal ayant brisé ses cervicales. Quelques jours après, Peter, avec sa tante, assistaient aux funérailles de Gwen, et le jeune homme décida de renoncer à sa double identité. Durant cinq mois, il visita sa tombe tous les jours, jusqu’au jour où, poussé par la police, sa tante et surtout le discours de Gwen elle-même lors de leur remise de diplôme, qu’il comprit qu’il devait être un héros, allant affronter Sytsevich, qui venait de réapparaître sous l’identité du Rhino.
Plus tard, Peter fut recruté au sein de la Spider-Armée pour le dernier assaut contre les Héritiers, sur la Terre-001.
Spider-Man possède des capacités physiques surhumaines ; il peut ainsi soulever au moins 20 tonnes. Son corps est aussi plus résistant que la normale ; il est doté de réflexes bien supérieurs à la moyenne et sa vitesse est également surhumaine, lui permettant de rattraper une voiture en courant. Il possède une endurance surhumaine, pouvant exercer une activité physique intensive bien plus longtemps qu’un être humain normal. Il est doté d’un extraordinaire sens de l’équilibre et d’une agilité fabuleuse. Il récupère également plus vite que la moyenne et cicatrise plus rapidement. Il est doté d’un sixième sens, ou sens d’araignée, qui l’avertit des menaces immédiates ; combiné avec ses autres capacités physiques, ce sens lui permet d’esquiver la plupart des attaques qui le visent. Enfin, il peut adhérer à toutes les surfaces, principalement par ses mains et ses pieds.
Peter est un génie scientifique, plus particulièrement dans les domaines de la chimie et de la physique.
Spider-Man a mis au point ses lance-toiles ainsi qu’un liquide synthétique qui se solidifie à l’air libre, formant une toile extrêmement solide.